中国辣椒 BCAT 基因家族鉴定、表达分析及克隆

【目的】了解中国辣椒（Capsicum chinense Jacq.）BCAT 基因家族成员的分布、性质及表达模式。中国辣椒是辣椒的 5 个主要栽培种之一,果实通常具有由支链酯类形成的浓郁果香。支链氨基酸转氨酶（BCAT,Branched-chain Aminotransferase）负责催化支链氨基酸合成相应 2- 氧代酸,是催化合成支链酯类的第一步反应酶。【方法】使用生物信息学分析和实时荧光定量 PCR 等方法对中国辣椒的 BCAT 基因家族成员进行鉴定、表达分析和克隆。【结果】获得 5 个 BCAT 基因家族成员,分别命名为 CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3、CcBCAT4和 CcBCAT5,随后对其进行生物信息学分析并克隆 CcBCAT1~CcBCAT4。生物信息学分析显示,这些基因分布于辣椒的 4 条染色体上,蛋白均为亲水性蛋白,氨基酸长度在 184~557 aa,分子量为 20.29~89.60 ku,等电点为 5.57~8.34。亚细胞定位预测结果显示,CcBCAT1 定位于叶绿体和线粒体,其他基因家族成员均位于叶绿体。CcBCATs 基因时空表达分析显示,CcBCAT1-4 基因具有组织表达特异性,CcBCAT2~CcBCAT4 相对表达量随着辣椒的成熟呈现逐步上升的趋势,其中 CcBCAT4 最为明显、CcBCAT1 则相反、CcBCAT5 未检测到表达。【结论】明确中国辣椒 BCAT 基因家族的表达模式,推测 CcBCAT4 参与辣椒果实相关次生代谢物合成。     

水稻穗发芽研究进展

作物收获前的穗发芽是一个严重的全球性农业生产问题。经过漫长的驯化过程,栽培作物的休眠 水平普遍低于野生祖先。尽管休眠期的缩短可能提高作物的繁殖代数和农业产值,但过早的休眠释放使作物在 成熟收获前发生穗萌发,造成巨大的经济损失。从穗发芽的生理基础、穗发芽相关 QTL 和基因、穗发芽防控及 展望等方面对水稻穗发芽现象进行梳理,认为高含水量是水稻种子萌发和穗发芽的先决条件,该过程中,淀粉 酶活性增强和可溶性糖含量升高为穗发芽提供能量,水稻籽粒中植物激素 ABA 和 GA 的含量及种子对二者的敏 感性是决定穗发芽的关键所在。近年来,穗发芽相关 QTL 及其功能基因的挖掘为阐明水稻穗萌机理以及培育穗 发芽抗性品种提供重要依据。从长远来看,广泛开展水稻种质资源鉴评,尤其在野生稻、地方品种中寻找丢失 的休眠基因,并通过分子育种途径聚集此类基因,培育抗穗萌品系（品种）,对于解决穗发芽问题、提高水稻 产量和品质、保证国家粮食安全具有重要意义。     

利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。     

玉米11个ZmbZIP基因的鉴定及表达特征分析

以玉米自交系郑58为试验材料,利用生物信息学方法和qPCR技术,设置200 mmol/L NaCl、20%PEG6000、4 ℃低温和硝态氮或铵态氮缺乏等胁迫试验,对11个ZmbZIP基因进行生物信息学分析,探测这些基因应答低温、干旱、盐害、缺氮等胁迫时的响应表达模式。系统进化树分析结果表明,11个ZmbZIP基因可以细分为2个亚组;qPCR分析结果表明,不同亚组的ZmbZIP基因在玉米不同组织中呈现不同的表达特征,同一亚组的基因呈现类似的表达模式,反映了ZmbZIP基因在玉米生长发育进程中生物学功能的保守性和分化性。人为模拟盐、干旱、低温和氮缺乏等胁迫的结果表明,ZmbZIP基因受到各种逆境因子的广泛调控,亚组I中的ZmbZIP1、ZmbZIP6和ZmbZIP13的表达量同时受NaCl溶液胁迫诱导而上调(相对表达量上调2倍),受PEG6000胁迫抑制下调;亚组II中的ZmbZIP38、ZmbZIP77、ZmbZIP112和ZmbZIP124同时受盐、PEG6000和低温胁迫诱导上调,硝态氮缺乏胁迫抑制ZmbZIP1、ZmbZIP6和ZmbZIP134基因表达,而铵态氮缺乏胁迫下,这3个基因表达明显上调,推测这些基因广泛参与应答逆境胁迫响应途径。     

基于Maize6H-60K芯片精准分型的玉米DH群体遗传规律研究

为解析玉米双单倍体(doubled haploid,DH)群体的遗传规律,使用自主研发的精准分型策略对‘先玉335’DH群体的Maize6H-60K芯片结果进行筛选校正和解析。结果表明:1)通过剔除单态、杂合、缺失标记,使用精准分型策略对标记准确聚类,获得的18 947个SNPs标记覆盖玉米全基因组。2)该群体在10条染色体上平均交换次数为1.84~1.03次,在6号染色体随体区域的交换次数显著减少。3)该群体在1、2、3、8号染色体上存在明显的偏分离现象;通过高频次、高密度的交换,染色体两臂端粒区域理论分离系数表现出回归到50%的趋势。利用获得的重组交换及分离规律可提高从DH群体中筛选到预期育种材料的准确性。     

甘薯响应蔓割病病原菌侵染的IbWRKY7基因克隆与表达分析

为探究IbWRKY7基因在甘薯响应蔓割病病原菌侵染过程中的表达模式,以高抗蔓割病品种‘鄂薯11’为供试材料,克隆到1个新的WRKY家族基因IbWRKY7,进行生物信息学分析;并对‘鄂薯11’和蔓割病敏感品种‘栗子香’在蔓割病病原菌侵染后IbWRKY7基因的表达模式进行分析。结果显示,IbWRKY7的CDS序列全长为945 bp,编码314个氨基酸;推测其编码不稳定的亲水性蛋白,蛋白分子质量为33.92 kU,pI 9.82,含有1个WRKY七肽保守序列和1个C₂HC型锌指结构。IbWRKY7基因上游2 000 bp的启动子区域内存在多种类型的顺式作用元件,如植物激素应答元件Myb、胁迫响应元件MYC和MYB等。多序列比对及系统进化树分析结果表明,IbWRKY7蛋白与日本牵牛花InWRKY7和三裂叶薯ItWRKY7亲缘关系最近。亚细胞定位预测显示IbWRKY7蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,与蔓割病病原菌侵染0 h相比,侵染2、4、12、24、48、72、96和120 h后,‘鄂薯11’的IbWRKY7基因表达量均显著提高(P<0.05);而‘栗子香’的IbWRKY7基因表达量除侵染24 h外的其他7个时间点均显著高于0 h。侵染2~48 h,‘鄂薯11’的IbWRKY7基因表达量显著高于‘栗子香’。双因素方差分析结果表明,不同品种和侵染时间点的IbWRKY7基因表达量均存在显著差异。综上,甘薯IbWRKY7基因上游2 000 bp的启动子区域含有12种激素应答和胁迫应答相关的顺式作用元件。IbWRKY7具有WRKY家族的典型结构特征,属于第Ⅲ类WRKY蛋白,氨基酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守。IbWRKY7基因受蔓割病病原菌侵染诱导表达,且在不同蔓割病抗性的甘薯品种中表达量差异显著。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

不同土地利用类型氨挥发氮同位素自然丰度特征

为了探讨不同土地利用类型下氨（NH3）挥发氮同位素自然丰度特征,采集3种土地利用类型（果园、菜地和林地）土壤,在可控条件下采用海绵吸收法开展了为期15d的室内培养试验,测定了不同土地利用类型下土壤NH3挥发全过程δ15N值及其变化规律。培养期间,3种土地利用类型下的土壤NH+4-N浓度均呈现先上升后下降的趋势;果园和菜...     

基于无人机遥感的松材线虫病识别定位与视频会商系统开发研究

为实现松材线虫病Bursaphelenchusxylophilus的有效识别和定位,开发了基于Java、C++和HTML编程语言,结合OpenCV开源库、CloudRoomSDK、GeoTools工具和MySql数据库的具有松材线虫病识别定位和视频会商两个模块的系统。该系统利用OpenCV算法对感病松树Pinus sp.进行识别和标绘,利用HTTP从数据库/服务器查询到的DEM数据,结合影像空间位置和姿态信息,实现无人机平台的单木水平松材线虫病的识别定位,感病松树定位水平偏移最小值为0.09 m,最大值1.77 m,平均误差为0.64 m,均方根误差为0.492 8 m;并基于视频编解码原理和Cloudroom SDK,开发了视频会商系统,实现了无人机实时视频流的网络传输和视频会商指挥通信功能。本系统对实现松材线虫病的精准识别与实施监测提供了方法借鉴。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响

【目的】克隆中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤-2’芪合酶（stilbene synthase）基因（STS）并研究其功能,为提高欧洲葡萄（V. vinifera）的白粉病抗性及品质提供依据。【方法】利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因VqSTS9和VqSTS21,构建植物过表达载体;用无核白单芽茎段诱导出分生愈伤组织,作为农杆菌介导法遗传转化的受体材料,获得抗性植株,经过不同水平检测,确定转基因植株;对野生型和转基因植株叶片人工接种葡萄白粉病菌（Uncinula necator）,通过显微技术观察叶片受白粉病菌侵染后的情况,比较两者对白粉病的抗性;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析野生型和转基因植株在自然条件和接种白粉病菌后STS及其相关基因的表达,用高效液相色谱法（HPLC）检测转基因植株中芪类物质的种类与含量。【结果】同源序列克隆得到VqSTS9（JQ868689）与VqSTS21（JQ868677）的cDNA序列,长度为1 179 bp。经PCR和Western blot检测,鉴定出过表达VqSTS9无核白植株4株和过表达VqSTS21无核白植株3株。显微观察发现,与野生型植株相比,转VqSTS9 和VqSTS21植株叶片上的菌丝生长较慢,表现出对白粉病的抗性。qRT-PCR结果表明,自然生长条件下,与野生型植株相比,转VqSTS9和VqSTS21植株STS的表达量提高,STS上游苯丙氨酸裂解酶基因（PAL）、下游白藜芦醇糖基转移酶基因（RSGT）、转录因子基因（MYB14、MYB15）的表达量均不同程度上升,而查尔酮合成酶基因（CHS）表达量降低;人工接种白粉病菌后,与野生型植株相比,转基因植株STS表达量显著上调。高效液相色谱分析表明,自然条件下,芪类物质主要以反式云杉新苷形式存在,转基因植株芪类物质的含量高于野生型植株;在接种白粉病菌诱导表达后,除了反式云杉新苷,还产生了反式白藜芦醇和葡萄素,即转基因植株体内芪类物质的种类和含量均有所增加。【结论】将VqSTS9、VqSTS21转入无核白后,转基因植株STS的表达量增高,芪类物质的含量与种类增加,并抑制白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’携带的VqSTS9和VqSTS21能够增强欧洲葡萄对白粉病的抗性,‘丹凤-2’可用作葡萄抗病性育种的种质资源。